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Le principe des puces à ADN
Les puces à ADN permettent de mesurer et de visualiser très rapidement
les différences d'expression entre les gènes et ceci à l'échelle
d'un génome complet. Si la mise en oeuvre de la technique est assez compliquée,
son principe est très simple. En voici les principales étapes:
La fabrication de la puce :
Les fragments d'ADN amplifiés par la technique de PCR sont déposés
sur une lame de microscope préalablement recouverte de polylysine (appelés
sonde). La polylysine a pour rôle d'assurer la fixation de l'ADN déposé
via des interactions électrostatiques. Les fragments de PCR sont dans
notre cas la partie exprimée (l'ORF) des 6200 gènes de Saccharomyces
cerevisiae (la levure du boulanger). La préparation de la lame est
achevée en bloquant la polylysine n'ayant pas encore accroché
d'ADN de façon à éviter que la cible ne puisse s'y fixer.
Juste avant l'hybridation, on dénature l'ADN pour qu'il se trouve sous
la forme simple brin sur la puce, ce qui lui permettra de s'accrocher au brin
complémentaire contenu dans la cible. En dehors des puces sur lames de
verre d'autres type de puces existent :
| Filtres haute
densité (macroarrays) |
Lames de verre (microarrays)
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Puces à
oligonucléotides |
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Détail :
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Détail :
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Détail :
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| Taille : 12cm x 8cm |
Taille : 5,4cm x 0,9cm |
Taille : 1,28cm x 1,28cm |
- 2400 clones par membrane
- marquage radioactif
- 1 condition expérimentale par membrane
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- 10000 clones par lame
- marquage fluorescent
- 2 conditions expérimentales par lame
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- 300000 oligonucléotides par lame
- marquage fluorescent
- 1 condition expérimentale par lame
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La préparation de la cible :
Les ARN sont extraits des deux cultures de levures dont on veut comparer l'expression.
Les ARN messagers sont ensuite transformés en ADNc par transcription
inverse. Lors de cette étape, l'ADN de la première culture est
marqué avec un fluorochrome vert, tandis que l'ADN de la seconde culture
est lui marqué en rouge.
L'hybridation :
Les ADN marqués en vert et ceux marqués en rouges sont mélangés
(la cible) et placés sur la matrice d'ADN simple brin déposée
(la sonde). La puce est alors incubée une nuit à 60 degrés.
A cette température, un brin d'ADN qui rencontre son complémentaire
s'apparie pour donner de l'ADN double brin. Les ADN fluorescents vont ainsi
s'hybrider sur les gènes déposés.
La lecture :
Chaque spot est excité par un laser et on récupère la fluorescence
émise via un photo-multiplicateur (PMT) couplé à un microscope
confocal.
On obtient alors deux images dont le niveau de gris représente l'intensité
de la fluorescence lue. Si on remplace les niveaux de gris par des niveaux de
vert pour la première image et des niveaux de rouge pour la seconde, on obtient
en les superposant une image en fausses couleurs composée de spots allant
du vert (seulement de l'ADN de la première condition fixé) au rouge (seulement
de l'ADN de la seconde condition fixé) en passant par le jaune (ADN des
deux conditions fixé en quantité égale).
L'analyse des données :
On a maintenant deux images de la puce à partir des quelles il faut réussir
à calculer le nombre de molécule d'ADN au départ. Pour
cela, on mesure la quantité de signal dans la longueur d'onde d'émission
du fluorochrome vert et la quantité de signal dans la longueur d'onde
d'émission du fluorochrome rouge. Puis on normalise ces quantités
en fonction de divers paramètres (quantité de levure de départ
dans chaque condition, puissance d'émission de chaque fluorochrome, ...).
On suppose alors que la quantité d'ADN fluorescent fixée est proportionnelle
à la quantité d'ARNm correspondant dans la cellule de départ
et on calcule le ratio fluorescence rouge / fluorescence verte. Si ce ratio
est supérieur à 1 (rouge sur l'image en fausses couleurs), le gène
est plus exprimé dans la seconde culture, si ce ratio est inférieur
à 1 (vert sur l'image en fausses couleurs), le gène est moins
exprimé dans la seconde culture. On peut visualiser ces différences
d'expression grâce à un logiciel développé dans le
laboratoire appelé Arrayplot (cf image ci dessous). Il permet d'obtenir
à partir de la liste des intensités de chaque points le nuage
de point intensité dans le rouge = f (intensité dans le vert).
Le regroupement en fonction des profils d'expression :
On peut ensuite essayer de regrouper des gènes ayant le même profil
d'expression sur plusieurs expériences ayant un rapport biologiques.
Ce regroupement peut se faire de proche en proche comme pour une phylogénie,
ce qui consiste à calculer un critère de similitude entre les
réponses et à rassembler les profils les plus similaires. On peut
également faire appel à des techniques plus complexes comme l'analyse
en composante principale ou les réseaux neuronaux.
Au final on représente en général le clustering hiérarchique
sous la forme d'une matrice où chaque colonne correspond à une
expérience et chaque ligne correspond à un gène. On représente
les ratio grâce à une échelle de couleur du vert (gènes
réprimés) au rouge (gènes induits).
Stéphane LE CROM et Philippe MARC
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